Специалисты из Центра живых систем МФТИ представили разработанную методику культивирования фрагментов сетчатки человека в лабораторной среде. Данный метод открывает возможность для тестирования эффективности вирусных векторов, используемых в генной терапии, до проведения дорогостоящих экспериментов на животных, что позволяет ускорить и сделать более безопасным процесс разработки методов лечения слепоты, возникающей из-за дегенерации фоторецепторов. О результатах исследования опубликованосообщается в издательстве Springer Nature Link в составе книги Retinal Gene Therapy: Methods and Protocols.

Современные методы лечения наследственных заболеваний сетчатки часто базируются на оптогенетической генной терапии: с использованием безопасного вирусного вектора в клетки сетчатки вводятся гены, кодирующие светочувствительные белки. Эти внедренные белки восстанавливают способность нейронов реагировать на свет, частично компенсируя утрату фоторецепторов и улучшая зрение. Уже имеются обнадеживающие результаты применения данной методики в клинической практике; например, испытания терапии на основе вируса AAV для гена RPE65 (мутации которого вызывают врожденный амавроз Лебера) продемонстрировали повышение зрительных функций у пациентов. Тем не менее, преждевременным будет говорить о широком применении этого подхода в медицине.

Традиционно доклиническая оценка эффективности новых вирусных векторов основывается на тестировании с использованием животных моделей и клеточных культур. Однако результаты, полученные на грызунах или даже приматах, нередко оказываются невоспроизводимыми в человеческом глазу. Различия в структуре сетчатки, экспрессии рецепторов на поверхности клеток и особенностях иммунной системы могут искажать получаемые данные. В результате перспективный вектор, демонстрирующий высокую специфичность к определенным типам клеток у животных, может оказаться неэффективным или даже токсичным при применении к человеку. Кроме того, такие эксперименты требуют значительных затрат времени и ресурсов, а также вызывают этические вопросы.

«Наша методика, предполагающая культивирование тканей сетчатки, полученных от донора, позволяет непосредственно исследовать взаимодействие вирусных векторов с человеческими тканями, при этом сохраняя сложную структуру и разнообразие клеточных типов. Однако этот процесс включает в себя несколько непростых этапов», – пояснил первый автор Алсаллум Алмакдад, руководитель группы генной терапии ретинопатии, научный сотрудник лаборатории геномной инженерии МФТИ.

В период шести часов, прошедших после констатации смерти донора, необходимо извлечь сетчатку и отделить ее от пигментного эпителия и стекловидного тела. После этого с использованием специального круглого инструмента для взятия биопсии диаметром 5 или 8 мм следует вырезать фрагменты одинакового размера из различных участков. Полученные фрагменты помещают на мембранные подложки с порами 0,4 микрона в специальный питательный раствор. При этом важно обеспечить, чтобы сетчатка не находилась во взвешенном состоянии в жидкости, а располагалась на границе раздела сред: питательные вещества поступают снизу через поры, доступ воздуха осуществляется сверху. Это позволяет создать условия, максимально приближенные к физиологическим, и поддерживать жизнеспособность ткани до двух недель.

«Изолируя сетчатку и культивируя ее, мы можем создать специальную среду для максимального сохранения жизнеспособности ткани. Что это дает? Это позволяет тестировать на конкретном органе новые ассоциированные вирусы или лентевирусы, а также другие платформы, которые рассматриваются как перспективные кандидаты для генной терапии. Достаточно в первый или второй день после выделения обработать сетчатку этими кандидатами и подождать 7–14 дней, чтобы они проникли в определенные клетки. Затем можно изучить образцы с помощью гистологии или флюоресценции, чтобы определить, где находятся вирусы и на какие клетки они воздействовали. Таким образом, это достаточно экономичный и эффективный метод скрининга новых терапевтических подходов», — отметил Алсаллум Алмакдад.

Для определения расположения вирусов через сутки после начала культивирования на поверхность сетчатки наносят вирусные частицы AAV, содержащие гены-репортеры, например флуоресцентный белок. Если вирус успешно проникает в клетки и активирует экспрессию гена, это проявляется свечением под микроскопом. На восьмой день после инфицирования, когда сигнал стабилизируется, проводится анализ. Один из способов – фиксация образца и криостатовое сечение на срезы толщиной 13 микрометров с последующей иммунофлуоресцентной окраской, что позволяет визуально определить типы клеток, подвергшиеся воздействию вируса.

Суть разработанного подхода заключается в объединении удобства клеточных культур с морфологической и функциональной сложностью цельного органа. В отличие от стандартных клеточных линий, эксплантат сохраняет все типы нейронов и глиальных клеток в их естественном расположении относительно друг друга и внеклеточном матриксе. Кроме того, здесь возможна прямая визуализация и манипуляции без опасений, связанных с влиянием кровотока и иммунного ответа. Важно отметить, что авторы разработали отдельные методики для различных зон сетчатки: макулярной (центральной, отвечающей за остроту зрения) и периферической. Это имеет большое значение, поскольку многие заболевания поражают определенные участки, например, макулярная дегенерация обычно начинается с центральной зоны.

Кроме того, с помощью данной модели возможно оптимизировать способ введения вируса: однократное нанесение на поверхность культивируемой ткани имитирует субретинальную инъекцию, а добавление препарата в среду – интравитреальный метод. Это дает возможность спрогнозировать влияние различных путей доставки на распределение вектора в клинической практике.

Предложенный метод имеет определенные ограничения, но, по сути, исследователи разработали биологическую модель для тестирования вирусов, которая гораздо реалистичнее стандартных клеточных культур. Это должно ускорить процесс создания терапии для таких заболеваний, как пигментный ретинит, болезнь Штаргардта и возрастная макулярная дегенерация, затрагивающих миллионы людей по всему миру.

Научная публикация: Alsalloum A., Khubetsova M., Mityaeva O., Volchkov P. (2026). — Культивирование образцов сетчатки человека как вне организма модель для генной терапии сетчатки . — В сборнике: Carvalho, L.S. (ред.) Генная терапия сетчатки: методы молекулярной биологии, том 3023. — Humana, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк. — https://doi.org/10.1007/978-1-0716-5198-8_7

Информация предоставлена пресс-службой МФТИ

Источник фото: ru.123rf.com