Ранее мы уже рассказывали о праймированном редактировании в 2019 году. В то время ученые из Гарварда разработали технологию, которая, по их мнению, может скорректировать около 89% известных генетических заболеваний, передающихся по наследству. За семь лет этот метод не только подтвердил свою эффективность, но и впервые был применен в клинической практике после проведения испытаний на людях. Тем не менее, процесс оказался более трудоемким, чем ожидалось.
Традиционный CRISPR-Cas9 представляет собой молекулярный инструмент, который разрезает обе цепи ДНК в определенной области, после чего клетка предпринимает попытку восстановления повреждения. Однако при этом нередко возникают неточности: могут непреднамеренно быть удалены или добавлены генетические последовательности. В связи с этим, данная технология не подходит для точного исправления конкретных мутаций. В 2019 году ученые предложили праймированное редактирование: они взяли «испорченный» Cas9, режущий только одну нить из двух, и прикрепили к нему обратную транскриптазу. Этот инструмент позволяет создавать новую цепочку ДНК, используя РНК как готовую «инструкцию по сборке». А еще они придумали гибридную pegRNA, что не только наводит Cas9 на цель, но и несет в себе черновик нужной правки.
Cas9 осуществляет разрезание только одной цепи ДНК, после чего освободившийся конец связывается с целевым участком на pegRNA, а обратная транскриптаза добавляет новый фрагмент непосредственно в образовавшийся разрыв. Таким образом, праймированное редактирование обеспечивает точное добавление или удаление определенных участков генетической информации, затрагивая лишь одну нить ДНК и действуя как своего рода «текстовый редактор». Тем не менее, в реальных условиях возникли трудности, связанные с эффективностью и доставкой.
В связи с выявленной низкой эффективностью метода в различных клеточных линиях, исследователи внесли ряд корректировок. Стало ясно, что клеточные нуклеазы, выполняющие функцию «молекулярных уборщиков», которые расщепляют ДНК и РНК, быстро разрушают один из концов цепочки pegRNA (ее «хвост»). Для защиты «хвоста» к нему был добавлен защитный псевдоузел epegRNA. В дальнейшем для предотвращения деградации РНК был добавлен также белок La, что позволило создать систему праймированного редактирования ДНК, названную PE7. С помощью метода непрерывной эволюции с использованием фагов (PACE) были найдены более компактные и активные варианты обратной транскриптазы, что привело к появлению PE6a и PE6b, значительно меньших по размеру, чем исходные версии. Это имеет важное значение для доставки генетического материала с помощью вирусных векторов — вирусов, используемых для переноса «биологических ножниц»).
Система репарации неспаренных оснований (MMR) представляет собой основное препятствие для технологии праймированного редактирования. Эта система, выполняющая функцию «контроля качества», следит за отсутствием ошибок и мутаций в ДНК, которые могут привести к развитию онкологических заболеваний и других патологий. Она также идентифицирует несоответствия в ДНК, возникающие в процессе редактирования, и нейтрализует внесённые изменения. Благодаря подавлению доминантно-негативного белка MLH1 удалось повысить эффективность этой технологии. В дальнейшем была поставлена задача расширения спектра участков генома, доступных для редактирования, и теперь данный подход позволяет воздействовать практически на любую позицию в геноме.
К тому же, возможности системы продолжают расширяться. Если ранее для корректировки требовалось лишь незначительное изменение 1-3 нуклеотидов, то сейчас появилась возможность введения целых генов. Это стало возможным благодаря применению двойных pegRNA, которые используют две направляющие РНК вместо одной. Они формируют комплементарные цепи с обеих сторон участка, подлежащего редактированию, и соединяют их. Таким образом, можно удалить фрагмент ДНК объемом до десяти тысяч пар оснований (технология PRIME-Del) или, наоборот, интегрировать новый генетический фрагмент.
Доставка представляет собой отдельную сложность. Аденоассоциированные вирусы (AAV) способны вместить лишь до 4,7 тысяч пар оснований, в то время как для полноразмерного праймированного редактирования необходимо около 6,3 тысяч пар оснований, и это без учета дополнительных конструкций. Были найдены некоторые решения данной проблемы. Например, белок можно разделить на две части, упаковать каждую из них в отдельный вирус, а затем соединить их внутри клетки. Так исправляли мышей с наследственной тирозинемией и с врождённой слепотой. Эффективность невысокая, но достаточная для клинического эффекта, так как исправленные клетки получают преимущество в росте.
Для создания вакцин на основе матричной РНК также могут использоваться липидные наночастицы (LNP). Внутри LNP можно поместить матричную РНК, кодирующую белок-редактор, а также химически модифицированные pegRNA. В печени мыши удалось добиться редактирование гена Pcsk9 на 8% является перспективным направлением для снижения уровня холестерина. Однако, липонуклеиновые частицы (LNP) склонны к накоплению в печени, поэтому для воздействия на мышцы или мозг требуются альтернативные методы. В качестве средства доставки можно применять вирусоподобные частицы (eVLPs), которые представляют собой вирусную оболочку, содержащую комплекс РНК для направленного редактирования. В 2024 году такие eVLP доставили комплекс праймированного редактирования в сетчатку мыши и исправили мутацию, вызывающую слепоту, с эффективностью около 15%.
Но самый надежный способ пока — ex vivo, что подразумевает изъятие клеток у пациента, их модификацию в лабораторных условиях и последующее возвращение в организм. Так впервые была применена технология праймированного редактирования в отношении человека. В 2025 году New England Journal of Medicine вышла статья о двух пациентах с редким наследственным иммунодефицитом — хронической гранулематозной болезнью (ХГБ). У них была мутация delGT в гене NCF1, из-за чего их нейтрофилы не могли убивать бактерии. Врачи забрали у пациентов стволовые клетки крови (HSPC), отредактировали их ex vivo с помощью праймированного редактирования, а потом вернули обратно после лёгкого курса химиотерапии, чтобы освободить место в костном мозге.
В итоге, доля модифицированных клеток в инфузионном препарате достигла 13-23% (определено по аллелям GTGT), а спустя месяц у второго пациента 83% нейтрофилов восстановили способность к выработке активных форм кислорода. Эта функция сохранялась в течение четырех и шести месяцев наблюдения, при этом не было выявлено значительных нежелательных реакций, связанных с использованием предварительного редактирования. Таким образом, первое in vivo применение на людях показало, что метод безопасен и функционально эффективен.
Действительно ли возможно устранение 89% вредоносных мутаций, как заявляли разработчики новой технологии еще в 2019 году? С технической точки зрения, прайм-редактирование способно воздействовать на подавляющее большинство известных точечных мутаций, однако этот «текстовый редактор» не всегда предсказуем. Тем не менее, технология уже применяется в клинической практике, и в настоящее время планируются новые испытания: для лечения серповидноклеточной анемии, метахроматической лейкодистрофии и муковисцидоза.