Оптимизация синтеза белков является ключевой задачей для современной биотехнологии. Она охватывает изменение последовательности аминокислот, подбор клеточных систем для экспрессии, оптимизацию состава среды культивирования, выбор способов выделения и очистки и многое другое. Потенциал улучшения каждого из этих этапов продемонстрировали исследователи Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ совместно с коллегами, изучая рецептор ангиотензина II первого типа (AT1). Данный белок критически важен для функционирования сердечно-сосудистой системы, поэтому он требует получения в чистой форме для проведения исследований. О результатах работы сообщается в журнале «Биохимия».
Рецепторы, сопряженные с G-белками, известные как GPCR (G-protein-coupled receptors), – это обширная группа мембранных белков, встречающаяся у разнообразных организмов. Они подвергаются воздействию множества сигнальных молекул, что обеспечивает регуляцию биохимических и физиологических процессов. Кроме того, GPCR являются целями для значительного числа лекарственных средств. В связи с этим, эти белки играют важную роль в биологии и медицине.
Для применения GPCR в экспериментах требуется их получение в очищенном виде. Обычно это достигается путем экспрессии в клеточных культурах, последующей экстракции, перевода в растворимую форму и очистки от посторонних веществ. Этот процесс представляет собой сложную задачу, поскольку биологические молекулы могут быть неустойчивыми и подвержены деградации в нетипичных условиях.
Это обуславливает потребность в совершенствовании методов производства рекомбинантных белков, и это справедливо и для GPCR. Исследователи из Московского физико-технического института, Объединенного института ядерных исследований (Россия, Дубна) и Чжэцзянского университета (Китай) взялись за решение этой задачи. Специалисты создали усовершенствованную технологию получения рецептора ангиотензина II первого типа АТ1. Он взаимодействует с ангиотензином – пептидным гормоном, который вызывает сужение кровеносных сосудов, повышение артериального давления и стимуляцию выработки альдостерона – гормона, синтезируемого корой надпочечников.
Для проведения современных исследований, таких как определение структуры белковой молекулы методом рентгеноструктурного анализа (РСА) с высоким разрешением, необходимо получать значительные количества рецептора AT1 в очищенном виде. Для этого требуется экспрессия рецептора в клеточных культурах. Клетки млекопитающих не подходят для данной цели, так как они характеризуются медленным делением и не обеспечивают достаточный выход белка. В связи с этим, исследователи из МФТИ выбрали более эффективную клеточную культуру Sf9, изначально полученную из куколок бабочки Spodoptera frugiperda (кукурузная лиственная совка).
Биофизики подчеркивают, что для эффективного проявления аминокислотной последовательности AT1 в клетках насекомого необходима модификация: в неё следует включить апоцитохром b562RIL, укоротить N-концевой домен и внести несколько мутаций. Эти изменения обеспечат термостабильность AT1. Кроме того, белок нужно перевести в растворимую форму, то есть солюбилизировать. Рецептор AT1 характеризуется низкой стабильностью в водных растворах, что существенно усложняет работу.
Чтобы улучшить экспрессию AT1, ученые провели оптимизацию в клетках линии Sf9. Эффективность этой оптимизации оценивалась по концентрации рецептора на клеточной мембране, поскольку его целевое расположение там непосредственно зависит от корректного сворачивания белка и посттрансляционных изменений.
Для повышения экспрессии рецептора в среду культивирования был добавлен его лиганд – кандезартан. Оказалось, что синтез AT1 в клетках насекомого без данного соединения не происходит. Это обусловлено проблемами со сворачиванием белка и последующей доставкой его в клеточную мембрану.
При работе с АТ1 в водных растворах ключевым фактором является его растворимость. Благодаря подбору подходящего поверхностно-активного вещества и установлению оптимальной концентрации, удалось повысить выход целевого продукта. Однако исследователи отмечают, что эффективность растворимости определяется сложной взаимосвязью различных факторов.
В заключение, исследование также показало, что ионное окружение влияет на количество полученного целевого белка и соотношение его мономеров. В частности, повышение ионной силы увеличило количество определенных рецепторов и изменило соотношение мономеров и олигомеров AT1, приблизив его к оптимальному значению.
Благодаря проведенным исследованиям, ученым удалось усовершенствовать этапы экспрессии, извлечения и очистки рецептора AT1. Это позволило повысить эффективность производства белка в клетках линии Sf9 и определить факторы, оказывающие решающее влияние на стабильность рецептора. Разработанная методика позволила увеличить концентрацию AT1 в клетках с нуля до 72%, а также повысить общий выход продукции примерно в четыре раза – до 100 микрограммов белка на 100 миллилитров биомассы клеток.
«Данная работа посвящена оптимизации процесса получения мембранного белка АТ1, который относится к рецепторам, сопряженным с G-белком. Этот рецептор выполняет важную функцию в регуляции артериального давления, а также в контроле выведения воды и ионов почками. Дисфункция АТ1 связана с развитием серьезных заболеваний, особенно сердечно-сосудистых, поэтому он является многообещающей целью для создания новых лекарственных препаратов. Мы улучшили протоколы экспрессии белка в клеточной линии Sf9 и его очистки, чтобы обеспечить возможность проведения дальнейших биофизических исследований» , — пояснил Иван Капранов, специалист лаборатории структуры и динамики биомолекул Центра исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, который работает в МФТИ.
В научной статье, написанной Капрановым И.А., Корном П.А., Дашевским Д.Э. и соавторами, рассматривается оптимизация производства рецептора ангиотензина II типа 1 для биофизических исследований. Статья «Оптимизация производства рецептора ангиотензина II типа 1 для биофизических исследований» была опубликована в «Биохимия. Дополнения к тому» (том 19, выпуск A, страницы 372–380) в 2025 году. DOI статьи: 10.1134/S1990747825700333
Информация предоставлена Центром научной коммуникации МФТИ