Специалисты из Китая разработали новый молекулярный механизм под названием smACGmax. Он позволяет одновременно модифицировать три различных типа нуклеотидов внутри определенного фрагмента ДНК. Данная технология имеет важное значение для целенаправленной эволюции генов, что открывает возможности для создания клеток с улучшенными характеристиками и ускорения процесса разработки фармацевтических препаратов.

Направленная эволюция in situЭтот процесс представляет собой искусственное воспроизведение естественного отбора в лабораторных условиях. Исследователи намеренно вводят большое количество случайных изменений в целевой ген, после чего выбирают наиболее эффективные из них. Данный подход позволяет значительно сократить время на создание белков и клеток с заданными свойствами, такими как устойчивость к патогенным микроорганизмам или вредным веществам.

В естественных условиях формирование подобных характеристик могло бы занять миллионы лет, либо не произошло вовсе. В настоящее время этот метод является весьма востребованным: практически одновременно были разработаны еще две системы, обладающие способностью к одновременной модификации нескольких нуклеотидов.

Авторы исследования, опубликованного в журнале Nature Communications, опираясь на принципы работы известной системы молекулярных ножниц CRISPR/Cas9 – инструмента для разрезания ДНК в заданных точках. Данный метод эффективен при необходимости деактивации нежелательных генов или интеграции определенной последовательности вместо вырезанного участка. Тем не менее, для целенаправленного изменения необходимо избегать разрывов генетического кода и осуществлять его модификацию с максимальным разнообразием вариантов.

Исследователи использовали модифицированный белок Cas9n, который не расщепляет ДНК на две части, в отличие от стандартного варианта Cas9, а лишь создает одиночный разрыв. Внутрь этого фермента была помещена группа других белков: цитозиновые и адениновые деаминазы (способные повреждать эти основания) вместе с ДНК-гликозилазой, удаляющей из цепи модифицированные фрагменты. Для выведения гуанинов в структуру добавили адаптированную версию человеческой гликозилазы. Полученный комплекс получил наименование smACGmax.

Принцип действия заключается в следующем: на одной нити ДНК формируется дефектное место, где отсутствуют поврежденные и удаленные основания, а вторая цепь, которую обычно восстанавливает система репарации, оказывается разрезанной. В таких условиях механизм восстановления оснований (BER) становится нефункциональным. Клеточные полимеразы, участвующие в транслезионном синтезе ДНК, случайным образом добавляют новые нуклеотиды на место утраченных аденинов, цитозинов или гуанинов.

Эффективность системы была проверена с использованием человеческих клеток HEK293T и HeLa. Ученые внесли изменения в ген HBEGF, отвечающий за выработку рецептора, который позволяет дифтерийному токсину проникать внутрь клетки. В результате работы редактора генетического кода образовалось множество случайных мутаций этого рецептора у клеток в культуре. Для отбора устойчивых вариантов в среду было добавлено токсичное вещество, и сохранились только те клетки, где модифицированный рецептор оказался нечувствительным.

В ходе исследования авторы указали на то, что успешное редактирование гуанинов пока возможно лишь при наличии определенной последовательности нуклеотидов (мотива NGR) вблизи этого основания, поэтому уровень замены гуанина оказывается ниже по сравнению с другими азотистыми основаниями.