Ученые разработали метод обнаружения уязвимостей в грибковых клетках с помощью флуоресцентных меток.

Новости МирТесен

Ученые разработали способ оперативной оценки реакции клеток дрожжей на противогрибковые вещества. Для этого исследователи применили набор штаммов пекарских дрожжей, в которых 64 белка, участвующие в основных метаболических процессах, были соединены с зеленым флуоресцентным белком GFP. Это позволило авторам в сжатые сроки получить информацию о воздействии ряда новых противогрибковых соединений. Анализ полученных данных способствует углублению понимания механизмов действия этих соединений и выявлению клеточных путей, которые могут стать целями для разработки новых лекарственных средств. Данный подход упростит и удешевит процесс поиска и тестирования медикаментов для лечения грибковых инфекций. Результаты исследования, поддержанного тремя грантами Российского научного фонда (РНФ), опубликованы в журнале Communications Biology.

Каждый год грибковые инфекции, такие как пневмонии и легочный аспергиллез, умирает более 1,5 миллиона человек во всем мире. При этом наибольшую опасность представляют штаммы болезнетворных грибов, устойчивые к существующим лекарствам. Количество же известных противогрибковых средств очень ограничено — существует всего несколько классов таких препаратов, и к ряду из них грибки — например некоторые виды кандиды, поражающие слизистые, — обрели устойчивость, а потому значительно хуже поддаются лечению. Для решения этой проблемы ученые ищут уязвимости в грибковых клетках, на которые можно нацелить новые препараты. Однако классические методы выявления таких мишеней (протеомный анализ, скрининг мутантных библиотек) требуют много времени и дорогостоящего оборудования.

Исследователи из Федеральный исследовательский центр РАН «Фундаментальные основы биотехнологии (Москва) с коллегами предложили простой и быстрый метод для выявления уязвимостей в грибковых клетках.

В ходе эксперимента авторы использовали пекарские дрожжи, представляющие собой удобный модельный организм, клетки которого характеризуются быстрым делением и нетребовательны к условиям культивирования. На первом этапе исследования, опираясь на базы данных о белках, ученые выделили 64 белка, играющих ключевую роль в клетках дрожжей: они обеспечивают синтез аминокислот – строительных компонентов белков, защищают клетки от окислительного стресса, выводят токсичные вещества, регулируют энергетический обмен и обеспечивают клеточное деление.

Из обширной коллекции дрожжевых штаммов было отобрано 64 варианта, в которых один из определенных белков был мечен флуоресцентным маркером — зеленым флуоресцентным белком GFP, присоединенным к нему. Под воздействием синего лазера этот белок испускает свечение в зеленой области спектра.

Затем авторы воздействовали на клетки, используя двенадцать различных препаратов, включая известные противогрибковые средства и новые, недостаточно изученные соединения. Исследователи с помощью прибора, фиксирующего свечение клеток, определяли, как менялась интенсивность флуоресцентных «маячков» в зависимости от применяемого препарата. Изменение свечения происходило, так как клетка, реагируя на токсическое вещество (противогрибковый препарат), изменяет уровень синтеза определенных белков, и эти изменения указывают на характер воздействия лекарственного средства.

Благодаря этой методике удалось исключить необходимость проведения трудозатратного протеомного анализа, требующего значительных временных ресурсов и дорогостоящего оборудования. В кратчайшие сроки исследователи смогли оценить клеточную реакцию на 12 различных соединений, что позволило им лучше понять принципы их воздействия. В частности, эксперимент предоставил возможность выявить ранее неизвестный механизм действия алкилцитидинов — нового класса соединений, обладающих противогрибковой активностью, и продемонстрировать их эффективность против грибков, повреждающих произведения искусства и картины.

Установлено, что алкилцитидины стимулируют биосинтез ароматических аминокислот, что напрямую связано с функционированием антиоксидантных систем клетки. Это дает возможность создавать лекарственные средства, которые смогут специфически воздействовать на данный процесс и эффективно подавлять рост патогенных грибов. Заслуживает внимания тот факт, что данный метаболический путь характерен для грибов, растений и бактерий, но не встречается у человека и животных. Следовательно, препараты, разработанные для воздействия на него, будут избирательно воздействовать на грибы, не оказывая негативного влияния на клетки человека.

«Наша методика дает возможность измерять реакцию клеток на противогрибковое соединение без трудоемкого протеомного анализа: достаточно измерить свечение клеток панели из 64 штаммов. Это позволяет получить результаты быстрее и с меньшими затратами по сравнению с полной протеомикой, и, что более существенно, да ет информацию о клеточных процессах, вовлеченных в ответ на лекарство. Мы можем быстро выявлять соединения с новыми механизмами действия, а не просто получать данные «вещество убивает грибную клетку или нет«. Метод отлично работает на модельных дрожжах, и в будущем мы надеемся расширить набор белков для более детальной характеристики механизмов действия отдельных соединений », — по словам Михаила Агафонова, доктора биологических наук и руководителя группы геномного редактирования промышленных микроорганизмов в ФИЦ Биотехнологии РАН, участника проектов, получивших поддержку от РНФ.

В исследовании принимали участие сотрудники Российского университета дружбы народов (Москва), Научно-исследовательский институт, занимающийся поиском новых антибиотиков, носит имя Г.Ф. Гаузе (Москва) и Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта, входящий в состав РАН (Москва).

Пресс-служба Федерального исследовательского центра биотехнологии Российской академии наук предоставила информацию и фотографии