Яд перуанского зеленого бархатного тарантула Thrixopelma pruriens содержит токсин ProTx-I, который избирательно блокирует ряд каналов на мембране клетки. Поэтому токсин может стать новым анальгетиком, однако сначала нужно научиться получать его в больших количествах и в правильной форме. Новое исследование ученых Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и МФТИ с коллегами из других научных центров России и Китая сравнило методы наработки ProTx-I в бактериях. Результаты опубликованы в Acta Naturae. Исследование проводилось при финансовой поддержке Российского научного фонда в рамках проекта 22-14-00326).
Соединения, содержащиеся в организмах, недостаточно изученных животных, растений и грибов, все чаще служат образцами для создания новых лекарственных препаратов. Особый интерес представляют яды пауков – уникальный источник биологически активных молекул, потенциально способных избирательно воздействовать на нервную и другие системы человеческого организма. В составе паучьих токсинов значительную группу составляют ноттины. Это небольшие пептиды, состоящие из 20–50 аминокислотных остатков и обладающие высокой структурной стабильностью, которые способны избирательно изменять функционирование клеточных мембран и рецепторов.
Ноттины отличаются высокой стойкостью, что затрудняет их разрушение при нагревании или воздействии химических веществ. Кроме того, они устойчивы к расщеплению: в отличие от большинства обычных белков, которые быстро разлагаются под действием ферментов в организме, ноттины к ним не чувствительны. Это обеспечивает длительное циркулирование таких пептидов в крови и позволяет им оказывать биологическое воздействие. В рамках нового исследования был рассмотрен представитель данного класса – паучий токсин ProTx-I.
Данное вещество и родственные ему соединения нередко служат образцом для разработки современных обезболивающих средств. Это объясняется тем, что они воздействуют на ионные каналы, играющие роль в ощущении и передаче болевых импульсов (NaV1.7, NaV1.8, TRPA1). Изучение взаимодействия этих токсинов со специфическими каналами посредством структурного и функционального анализа позволяет создавать новые лекарственные средства для лечения боли и связанных с ней неврологических воспалительных состояний, используя принципы рационального дизайна.
ProTx-I — это небольшой белковый пептид, состоящий из 35 аминокислотных остатков. Структуру молекулы стабилизируют дисульфидные связи, образующиеся между аминокислотами, содержащими серу, формируя уникальный мотив, известный как ингибиторный цистиновый узел. Воссоздание подобной структуры при искусственном синтезе токсина с использованием микроорганизмов является сложной задачей, однако необходимо для изучения его характеристик. Для производства в промышленных масштабах, в случае разработки нового лекарственного препарата на основе ProTx-I, также потребуются биотехнологические методы.
Изучением этого вопроса, имеющего важное практическое значение, занимались специалисты из Института биохимической физики РАН, Московского физико-технического института, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и Шэньчжэньского МГУ-ППИ Университета (Китай). В ходе исследования они сопоставили различные методы производства ProTx-I с использованием генетически модифицированных бактерий E. coli. Попытки синтеза пептида в цитоплазме бактерии путём включения его в состав слитых белков с тиоредоксином и глутатион-S-трансферазой привели к нарушению правильной трёхмерной структуры ProTx-I.
Необходимость поиска новых методов стала причиной успеха. Одним из них является непосредственная экспрессия белка в цитоплазме, но не в растворенном состоянии, а в виде включений. Так называют крупные нерастворимые агрегаты, состоящие из молекул, которые формируются в бактериях при производстве рекомбинантных белков. Впрочем, в данном случае белковые молекулы нуждаются в предварительной ренатурации – процессе, позволяющем восстановить их правильную структуру.
Альтернативный действенный подход заключается в выделении ProTx-I, соединенного с белком, осуществляющим связывание мальтозы, в периплазматическое пространство бактерии. Это область, расположенная между внутренней (цитоплазматической) и внешней мембранами у грамотрицательных бактерий и часто называемая «внешним отсеком.
Для оценки активности ProTx-I использовали ооциты шпорцевой лягушки Xenopus laevis — модельные клетки получили широкое распространение в электрофизиологических исследованиях. Они дают возможность оценить состояние ионных каналов и рецепторов, расположенных на мембране, что проявляется в изменениях тока, проходящего через нее. В ооциты были введены гены, содержащие информацию для синтеза каналов TRPA1 человека и крысы. Этот хемочувствительный канал, реагирующий на химические сигналы, представляет собой значимую цель для разработки препаратов, направленных на лечение болевых и воспалительных неврологических расстройств.
По результатам исследований выяснилось, что человеческие рецепторы демонстрируют в три раза меньшую чувствительность к токсину, чем рецепторы крыс. Ранее проведенные работы показали, что TRPA1 каналы у мышей реагируют на ProTx-I менее интенсивно, чем у людей. Исследователи полагают, что расхождения в воздействии токсина на рецепторы разных видов обусловлены существенными изменениями в аминокислотной последовательности внеклеточных петель канала TRPA1 (S1-S2 и S3-S4), которые выступают в качестве основного участка связывания ProTx-I. Также было установлено, что включение всего одной дополнительной аминокислоты (метионина) в N-усечение C-концевой последовательности белка приводит к существенному уменьшению активности токсина паука.
«Созданная нами система бактериального производства токсина ProTx-I предоставляет значительные возможности для исследования воздействия этого токсина на работу канала. В частности, полученные образцы сразу же позволили нам обнаружить любопытные характеристики токсина. Анализируя его влияние на ионные токи через мембраны ооцитов Xenopus, экспрессирующих каналы TRPA1 крысы и человека, мы установили, что N-концевой участок играет ключевую роль в обеспечении функциональности токсина» ,— подчеркнула Екатерина Люкманова, профессор кафедры физико-химической биологии и биотехнологии Физтех-школы биологической и медицинской физики Московского физико-технического института.
В научной статье, авторами Shulepko M. A., Zhang M., Zhivov E. A., Kulbatskii D. S., Paramonov A. S., Che Y., Kuznetsov A. V., Popov A. V., Kirpichnikov M. P., Shenkarev Z. O., Lyukmanova E. N., рассматривается рекомбинантное производство, видоспецифическая активность в отношении TRPA1-канала и значимость N-концевого остатка токсина ProTx-I, выделенного из яда тарантула Thrixopelma pruriens. Статья опубликована в журнале Acta Naturae в 2025 году, том 17, номер 4, страницы 121–129. DOI: 10.32607/actanaturae.27590
Информация предоставлена пресс-службой МФТИ