Российские ученые создали новый комбинированный метод, предназначенный для выявления сайтов связывания лекарственных средств, используемых в фотодинамической онкотерапии, с белком, участвующим в доставке препаратов в человеческий организм. Этот подход позволит ускорить поиск наиболее действенных лекарств от рака и уменьшить вероятность возникновения нежелательных эффектов. Исследование было проведено специалистами Новосибирского государственного университета, Международного томографического центра СО РАН и РТУ МИРЭА.
Результаты исследования опубликованы в Journal of the American Chemical Society. Публикация в таком авторитетном и широко цитируемом журнале сама по себе является достижением для начинающих ученых. Принятие статьи в раздел «Выбор редакции» («Editor’s Choice») подчеркивает признание разработки со стороны международного научного сообщества. Первый автор публикации — аспирант второго курса кафедры химической и биологической физики физического факультета НГУ, а также младший научный сотрудник Лаборатории электронного парамагнитного резонанса Международного томографического центра Михаил Колоколов получил престижную молодежную награду от Международного общества ЭПР-спектроскопии за лучшую научную работу. Свое исследование молодой ученый проводил вместе с аспирантом 4 года той же кафедры Натальей Санниковой под научным руководством доктора физико-математических наук Олеси Крумкачевой.
Попадая в организм, лекарственные средства в первую очередь взаимодействуют с белками крови. Эффективность препарата определяется тем, насколько прочно он связывается с сывороточным альбумином – белком плазмы крови, выполняющим транспортную функцию. Степень связывания с этим белком существенно влияет на фармакологическое действие. Избыточное связывание приводит к снижению концентрации лекарства в крови, а недостаточное – к его неравномерному распределению или преждевременной деградации, препятствующей достижению терапевтического эффекта.
— Для разработки действенного лекарственного средства и контроля за его взаимодействием с транспортным белком необходимо знать, в каких точках белка происходит прикрепление молекул препарата. Определение таких участков позволит понять механизм действия лекарств, предсказать возможные побочные эффекты и установить причины невосприимчивости к ним у некоторых пациентов. Однако традиционные методы структурной биологии оказываются недостаточными, если существует несколько сайтов связывания или взаимодействие препарата с поверхностью белка нестабильно. В таких случаях исследователи используют метод молекулярного моделирования, однако его результаты также оказываются неполными, поскольку лекарственные препараты часто связываются с белком в нескольких точках. Так, на один белок одновременно и в различных местах могут прикрепляться несколько малых молекул лекарственного вещества. Это приводит к большому количеству возможных конфигураций таких комплексов, что затрудняет их учет при молекулярном моделировании. Мы разработали собственный комбинированный подход, позволяющий измерять расстояние между различными компонентами комплекса и использовать эти данные для определения его структуры. Предыдущие методы предоставляли усредненные значения, в то время как в нашем случае удается достичь атомарной точности в измерении распределения расстояний между сайтами связывания, «видеть» все возможные конформации (то есть пространственные расположения атомов в молекуле определенной конфигурации) и находить места, где малые молекулы вещества связываются с белком. Это и есть ключевой элемент нашей работы. В нашем подходе мы измеряем расстояния внутри комплекса с помощью спиновых меток. Специальная малая молекула, содержащая неспаренный спин, селективно вводится в известный нам участок белка. После связывания белка с лекарством мы можем измерять спин-спиновые расстояния между спиновой меткой и молекулами лекарства на белке, — объяснил Михаил Колоколов.
При разработке методики исследователи объединили молекулярное моделирование и экспериментальные данные, полученные с помощью электронного парамагнитного резонанса. Этот метод позволяет определить структуру соединений, анализируя их поглощение микроволнового излучения. Сначала с помощью расчетов были определены потенциальные места связывания лекарственного препарата с белком, затем проведены исследования методом ЭПР-спектроскопии. Полученные экспериментальные данные и результаты компьютерного моделирования были использованы для уточнения структуры этих мест. Работа была осуществлена аспирантами физического факультета НГУ и младшими научными сотрудниками Лаборатории ЭПР Международного томографического центра Михаилом Колоколовым и Натальей Санниковой. Анализ показал, что взаимодействие с фотосенсибилизаторами может осуществляться в нетипичных областях альбумина и в нескольких местах одновременно.
— В принципе, без проведения экспериментов можно определить места связывания молекулы с белком, используя только расчетные методы. Однако на практике эти методы оказываются неточными и содержат ошибки, поскольку применяемые алгоритмы достаточно упрощены. Поэтому ученые часто сомневаются в достоверности полученных результатов. Кроме того, расчетные методы могут предложить несколько потенциальных участков связывания и их расположения, причем эти варианты могут казаться одинаково вероятными. Возникает вопрос о том, какой из них является правильным. Таким образом, расчетный метод недостаточно точен и не может быть единственным способом решения задачи, однако он все же полезен, поскольку указывает направление для экспериментального поиска и позволяет ограничить область, в которой могут находиться потенциальные места связывания. Благодаря этому мы можем использовать экспериментальные данные о расстояниях, в достоверности которых мы уверены, в сочетании с расчетными методами, чтобы с достаточной точностью определять взаимодействие молекулы с белком, — рассказал Михаил Колоколов.
В ходе изучения взаимодействия альбумина и фотосенсибилизаторов был протестирован разработанный учеными комбинированный метод.
Фотосенсибилизаторы – это природные или синтезированные соединения, применяемые в медицине, в частности, в фотодинамической терапии (ФДТ). В этом методе они концентрируются в пораженных клетках и, под воздействием света, активируются, что приводит к их уничтожению.
Фотодинамическая онкотерапия представляет значительный интерес, поскольку, в отличие от традиционной химиотерапии, она воздействует исключительно на опухолевые ткани, которые затем подвергаются воздействию света. Тем не менее, на данный момент этот метод лечения рака не получил широкого распространения из-за недостатков фотосенсибилизаторов. Перед исследователями стоит задача повышения эффективности поглощения света этими веществами, улучшения их распределения в организме и увеличения их накопления в опухолях. Изучение взаимодействия фотосенсибилизаторов с альбумином имеет важное значение для совершенствования их распространения и достижения более высокой концентрации в опухолях, что, в свою очередь, будет способствовать повышению эффективности терапии. Таким образом, исследования в этой области представляют собой задачу, имеющую важное клиническое значение.
Исследователям удалось установить места связывания для семи веществ, особенности взаимодействия с альбумином которых до этого момента были не до конца понятны. Примененный метод продемонстрировал, что соединение может происходить в необычных областях альбумина и в нескольких местах одновременно, в зависимости от вида фотосенсибилизатора.
Ученые оценили результативность разработанного ими комбинированного подхода, используя несколько фотосенсибилизаторов. Для иллюстрации различных способов взаимодействия они выбрали соединения, чьи молекулы обладают разным электрическим зарядом: отрицательным, положительным и нейтральным. В результате было установлено, что в зависимости от этого параметра, взаимодействие происходит по-разному с белком, который сам имел отрицательный заряд. Молекулы с положительным или нейтральным зарядом формируют на его поверхности нестабильную связь, характеризующуюся временным разъединением и повторным присоединением.
Отрицательно заряженные молекулы демонстрируют иную модель поведения: они проникают в углубления на поверхности белка и удерживаются там. При этом значительное влияние оказывает их размер. Небольшие молекулы полностью заполняют эти углубления, формируя прочное взаимодействие, в то время как более крупные проявляют себя по-другому.
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что чем меньше и плотнее молекула входит в эти карманы, тем выше посещаемость сайта, тогда как при работе с более крупными молекулами, которые не так свободно встраиваются в эти карманы, посещаемость снижается, а связывание становится менее результативным. Исследователи непосредственно наблюдали эти процессы в ходе экспериментов. Подобное поведение молекул представляется логичным, однако расчетные модели не учитывают его. При их использовании можно установить, каким образом молекула присоединяется к белку, но не удается определить, как это влияет на сам белок. Если в карман свободно входят небольшие молекулы, существенных изменений не отмечается. Однако крупные молекулы способны изменять структуру белка. Расчетные методы часто не регистрируют это явление, но в экспериментах исследователи скорректировали эти ошибки и неточности.
— В процессе проведения всех экспериментов в рамках данного исследования мы с высокой точностью определили места связывания молекул исследуемых соединений с альбумином, что представляет собой принципиально новый подход в разработке фотостабилизаторов. Использованный нами комбинированный метод позволит существенно повысить точность анализа противораковых соединений и упростить процесс создания новых препаратов для онкотерапии, сократив его продолжительность. Благодаря сочетанию компьютерного моделирования и данных электронной парамагнитной резонансной спектроскопии нам удалось значительно уменьшить объем трудоемких вычислений и экспериментов, а также облегчить определение взаимодействия между альбумином и фотосенсибилизаторами. Мы полагаем, что наша работа позволит прогнозировать наиболее эффективные для фотодинамической терапии рака соединения. В дальнейшем мы намерены использовать разработанный нами метод для изучения связывания фотосенсибилизаторов с молекулами ДНК, — рассказал Михаил Колоколов.
Сообщение поступило из пресс-службы Новосибирского государственного университета