Специалисты физического факультета МГУ совместно с российскими и бельгийскими учеными создали новый генетически кодируемый флуоресцентный белок HyPerFLEX. Его свечение зависит от уровня перекиси в клетке, а цвет можно изменять, используя внешние флуорогены. Пероксид водорода, являясь продуктом дыхания эукариотических клеток, участвует во многих сигнальных путях, регулирующих метаболизм.
Разработанный индикаторный белок отличается высокой чувствительностью и избирательностью в отношении перекиси, а также демонстрирует устойчивость к изменениям кислотности. Это, в свою очередь, впервые предоставило возможность отслеживать окислительный стресс в эндоплазматическом ретикулуме клетки. Использование двухфотонной флуоресцентной микроскопии с белками, имеющими сдвинутую в красную область спектральной чувствительности, позволило впервые визуализировать изменения концентрации перекиси в нейронах глубоких слоев мозга мыши.
Исследование, финансируемое национальным проектом «Наука и университеты» и Российским научным фондом (грант № 22-72-10044), дало следующие результаты), опубликованы в журнале Nature Chemical Biology.
Перекись водорода (H2O2) выступает в роли универсального сигнального вещества в клетке, образующегося в ответ на различные факторы, включая факторы роста, гормоны и цитокины. Она также задействована в процессе переноса электронов на внутренней мембране митохондрий во время дыхания. Благодаря продолжительному периоду существования, перекись водорода функционирует как вторичный мессенджер, передавая сигналы к окислительно-чувствительным мишеням в ядре и в другие клеточные структуры, посредством окисления их тиольных групп.
Использование генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов (ГКФИ) стало важным шагом вперед в исследовании H2O2 в клетках, позволяя проводить измерения с высокой точностью как во времени, так и в пространстве, и направленно изучать отдельные клеточные структуры. Однако, до недавнего времени, все разработанные чувствительные сенсоры основывались на зеленых флуоресцентных белках. Это ограничивало возможность их одновременного применения в разных органеллах клетки и затрудняло их комбинирование с другими сенсорами.
В качестве молекулярной основы для разработки нового индикатора был использован флуоресцентный белок FAST, способного связывать различные молекулы, напоминающие флуорофоры (флуорогены), приводит к изменению его окраски. Внедрение специфического, высокочувствительного молекулярного участка OxyR в специальное место белка cpFAST заставило его изменять яркость свечения в зависимости от концентрации H2O2. Созданный таким образом индикатор HyPerFLEX продемонстрировал высокую чувствительность и селективность, а его стабильность к кислотности среды позволяет работать в самых неблагоприятных условиях. Важнейшей особенностью разработанной молекулярной платформы стала возможность реализовать флуоресцентный индикатор любого оптического диапазона от синего до ближнего инфракрасного (ИК). Благодаря этой особенности впервые был показан транс-компартментный транзит H2O2 в клетке. Сформированная локально в митохондриях перекись была зафиксирована последовательно в цитозоле и ядре при помощи трех различных по цвету сенсоров. Разработанный сенсор являлся важнейшим недостающим элементом для проведения многопараметрических исследований окислительного стресса в живых системах с клеточным разрешением. Потенциал визуализации сенсоров семейства HyPerFLEX в живых тканях ученые раскрыли при помощи многофотонной флуоресцентной микроскопии.
«Биоткани характеризуются значительным рассеянием света, что делает неэффективными традиционные методы визуализации флуоресцентных меток в живых организмов. Методики микроскопии с двух- и трехфотонным возбуждением белков, разрабатываемые в нашей лаборатории, позволяют снизить рассеяние возбуждающего света и существенно повысить локализацию флуоресцентного сигнала. Мы провели исследование двухфотонных спектров возбуждения сенсора HyPerFLEX с использованием различных флуорогенов для достижения его оптимального многофотонного возбуждения. Результаты показали, что высокая яркость сенсоров HyPerFLEX с красными флуорогенами позволяет отслеживать изменения концентрации пероксида водорода в нейронах живого мозга мыши на глубине до 350 мкм» , — подчеркнул один из авторов работы, ведущий научный сотрудник кафедры общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ Александр Ланин.
Новые молекулярные сенсоры перекиси водорода (H2O2) задают новую планку в визуализации окислительно-восстановительных реакций в биологических системах. Они характеризуются повышенной чувствительностью, широким спектральным диапазоном и устойчивостью к внешним факторам, что обеспечивает более точное отображение окислительных сигналов внутри клеток и тканей живых организмов в режиме реального времени. Благодаря сочетанию достоинств этих и других сенсоров, ученые получили беспрецедентную возможность отслеживать сложные изменения концентрации H2O2 и расширить представления о его разнообразных функциях в нормальных метаболических процессах и при возникновении заболеваний.
В исследовании задействованы специалисты из РНИМУ им. Н.И. Пирогова, ИБХ РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, ФЦМН ФМБА, РКЦ, ЛИФТ Центра и Брюссельского центра редокс-биологии.
Информация предоставлена пресс-службой МГУ