В 2014 году учёных наградили Нобелевской премией по химии за создание наноскопии – метода биовизуализации сверхвысокого разрешения, позволяющего видеть отдельные молекулы. Но эта методика давала возможность делать только мгновенные снимки в течение нескольких десятков секунд. Вдохновлённые этой методикой, исследователи разработали концепцию сверхразрешения «PINE», которая продлевает наблюдения до 250 часов и открывает ранее невиданные детали деления клеток на молекулярном уровне.
В природе любая структура, будь то живая или иная, создаётся и упорядочивается путем соединения миллиардов отдельных частей. Эта динамика сборки действует как минимум на три уровня по размеру или длине и как минимум на пять уровней по времени. Сверхразрешение произвело революцию в биоимиджинге, предоставляя возможность изучать эту динамику до масштабов не более 10 нанометров, что эквивалентно разрешению в 100 атомов.
Методы сверхразрешения обычно основаны на искусственном фотообесцвечивании для освещения молекул, помеченных флуорофором. Это приводит к отражению света, который исчезает через несколько десятков секунд. Несмотря на высокое разрешение получаемых изображений, данный протокол вызывает необратимые изменения и сокращает время наблюдения, что непригодно для изучения биомолекулярных процессов длительного действия.
«Живая клетка – кипящий центр, где постоянно рождаются и действуют белки. Наша технология обладает высоким разрешением и прекрасно отображает эту активную жизнь. » — подчеркивает в сообщении для прессы Гуанджи Цуй, аспирант кафедры электротехники и вычислительной техники Мичиганского университета и один из создателей новой методики. Новая методика, описанная в журнале Nature Communications, позволяет увеличить диапазон наблюдения с суперразрешением до 250 часов.»
Разработанное Цуи и его коллегами устройство – это наноскоп с фазовой интенсивностью без отбеливания (PINE). В него входит многослойная тонкая пленка из поливинилового спирта и жидкокристаллических полимеров. Эта пленка обеспечивает случайное распределение золотых нанозондов, заменяющих флуорофоры, и предотвращает фотообесцвечивание.
Ранее проведенные исследования доказали эффективность метода нанозондов в обеспечении упругого рассеяния света без изменения цвета и достижения повышенной разрешающей способности. Но эти методы страдали от смещения, снижающего точность изображения. Доступ к использованию всего нескольких нанозондов также представляло ограничение, ведь для получения оптимальных изображений наблюдаемых структур необходима тысяча таких зондов. Более того, полученное сверхразрешение не превышало 10 нанометров.
Протокол исследователей из Мичигана позволяет использовать популяцию нанозондов численностью несколько тысяч и достичь разрешения менее 10 нанометров. Наностержни реагируют на свет, который полимерная пленка обнаруживает при отражении с точностью по фазе. Такая точность позволяет выбирать наностержни в зависимости от угла падения света. Записав от 10 до 30 изображений, каждое из которых снято под разным углом наностержня, и объединив их в одно изображение, команда смогла наблюдать детали белкового масштаба в клетке. В обычном микроскопе эти детали были бы размыты.
«Мы можем осуществлять долговременную наноскопию объектов размером менее 10 нм и наблюдать формирование больших структур, состоящих из сотен клеточных построек (> 900) в клетках, чего нельзя добиться с помощью существующей флуоресценции. «, — говорится в их исследовании.
Увеличение невиданных ранее деталей
Чтобы проверить новую методику, учёные пытались обнаружить актин — нитевидный белок, поддерживающий клетки, диаметром около 7 нанометров. Несмотря на то, что нанотиды примерно в два раза меньше белков, разкрывают беспрецедентные подробности процесса деления клетки. Хотя понимаем основы этого процесса, он остаётся во многом загадочным из-за ограниченности технологий наблюдения.
Методика PINE позволила наблюдать набор из 904 актиновых филаментов и показать, что во время деления клетки они расширяются, удаляясь друг от друга. Затем это расширение приводит к их сближению, позволяя вновь соединиться. Этот процесс сдерживается тенденцией белковой сети к расширению и притяжению других соседних белков. В результате результирующая сеть имеет тенденцию сжиматься тем сильнее, чем больше в ней связей, и расширяться, если в ней меньше связей.
Обнаружено тесное взаимосвязь между поведением актина и клеткой-хозяином. Расширение белковой сети сопровождается сжатием клетки-хозяина, а в обратном случае клетка-хозяин сжимается при расширении белков. Такая противоречивая динамика впервые наблюдается у исследователей, которые стремятся понять ее последствия и влияние в будущем. По их предположению, дерегуляция этого процесса может стать причиной некоторых заболеваний.