Несмотря на развитие средств геномной инженерии в последнее десятилетие, исследователям все еще не хватает надежных методов для точной вставки больших последовательностей ДНК. Используя систему редактирования генов CRISPR, исследователи Массачусетского технологического института разработали новый инструмент, который позволяет удалять крупные дефектные гены и заменять их новыми более безопасно и эффективно. Таким образом, эта методика имеет потенциал для лечения различных генетических заболеваний.
Первое поколение CRISPR могло разрезать ДНК, второе поколение позволяло редактировать базы, а с третьим поколением появилось прайм-редактирование — возможность вносить небольшие изменения (вставки и удаления пар оснований).
Но исследователи по-прежнему ограничивались небольшими делециями и вставками, оставляя пустоту в несколько тысяч пар оснований в области редактирования генов. Разработка командой Массачусетского технологического института четвертого метода устраняет эти недостатки. Названный PASTE, он может «перетаскивать» ДНК на тысячи пар оснований с точностью, основанной на CRISPR, в геном.
Недавно, используя этот метод, те же исследователи показали, что они могут доставлять гены длиной 36 000 пар оснований ДНК в несколько типов человеческих клеток, а также в клетки печени мыши, не повреждая ДНК. Этот новый метод может стать перспективным для лечения заболеваний, вызванных дефектными генами с большим количеством мутаций, таких как муковисцидоз. Их исследование опубликовано в журнале .
Перетаскивание вместо вырезания и вставки
Система редактирования генов CRISPR-Cas9 состоит из фермента Cas9, разрезающего ДНК, и короткой нити РНК, которая направляет фермент к определенному участку генома, подлежащему разрезанию. Когда Cas9 и направляющая РНК, нацеленная на ген заболевания, доставляются в клетки, в геноме делается специфический разрез, и процессы восстановления ДНК клеток склеивают два конца вместе, часто удаляя небольшую часть генома.
Чтобы избежать такой потери информации, исследователи могут доставить последовательность ДНК для включения одновременно с вырезанием (как при вырезании и вставке). Но этот метод повреждает целевую ДНК, вызывая двунитевые разрывы, что может привести к делециям или хромосомным перестройкам, вредным для клеток.
Поэтому новый инструмент сочетает в себе точное нацеливание CRISPR-Cas9 с ферментами, называемыми интегразами, которые вирусы используют для вставки собственного генетического материала в геном бактерий.
В данном исследовании ученые сосредоточились на сериновых интегразах, которые могут вставлять огромные куски ДНК, до 50 000 пар оснований. По словам авторов, эти ферменты нацелены на определенные геномные последовательности, называемые участками связывания, которые функционируют как «посадочные площадки». Когда они находят подходящую посадочную площадку в геноме хозяина, они связываются с ней и интегрируют свою полезную нагрузку ДНК.
Новый инструмент, PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements), состоит из фермента Cas9, который делает разрез на определенном участке генома, направляемый нитью РНК, связывающейся с этим участком. Это позволяет им выбрать любое место в геноме для вставки посадочного участка, который содержит 46 пар оснований ДНК. Поскольку это небольшой фрагмент, вставка не приводит к двунитевым разрывам.
После того как посадочный участок включен, интеграза может прибыть и вставить свою гораздо более крупную полезную нагрузку ДНК в геном в этом месте.
Джонатан Гутенберг, сотрудник Института исследований мозга Макговерна при Массачусетском технологическом институте, говорит в своем заявлении: «Мы считаем, что это большой шаг к осуществлению мечты о программируемой вставке ДНК. Это техника, которую можно легко адаптировать как к месту, которое мы хотим интегрировать, так и к грузу.
Общая надежда на лечение многих заболеваний
В этом исследовании ученые показали, что с помощью PASTE они могут вставлять гены в несколько типов клеток человека, включая клетки печени, Т-клетки и лимфобласты (незрелые белые кровяные клетки).
Они протестировали систему доставки с 13 различными полезными генами, некоторые из которых могут быть терапевтически полезными, и смогли вставить их в девять различных мест генома. В эти клетки исследователи смогли вставить гены с успешностью от 5 до 60%.
Исследователи также продемонстрировали, что они могут вставлять гены в «очеловеченную» печень мыши, которая примерно на 70% состоит из человеческих гепатоцитов. PASTE смог интегрировать новые гены примерно в 2,5% этих клеток.
В настоящее время исследователи продолжают изучать возможность использования этого инструмента в качестве средства замены дефектного гена муковисцидоза. Этот метод также может быть полезен для лечения заболеваний крови, вызванных дефектными генами, таких как гемофилия и дефицит G6PD, или болезни Хантингтона.
Исследователи разместили свои генетические конструкции в Интернете для использования другими учеными. Последовательности ДНК, которые исследователи ввели в это исследование, были длиной до 36 000 пар оснований, но они считают, что можно использовать и более длинные последовательности.