Специалисты Приволжского исследовательского медицинского университета (ПИМУ) разрабатывают новые подходы к применению света в биологических и медицинских исследованиях. Фотоны, обладающие уникальными свойствами, позволяют изучать живые клетки, ткани и органы, а также воздействовать на них. Одно из направлений биофотоники – флуоресцентная визуализация с временным разрешением – прокомментировал кандидат физико-математических наук Владислав Игоревич Щеславский. Под его руководством в России впервые создан инновационный метод быстрой диагностики различных заболеваний тканей, основанный на определении времени флуоресценции. Подробности – в нашем интервью.
Справка: Владислав Игоревич Щеславский ― кандидат физико-математических наук, заведующий лабораторией оптической спектроскопии и микроскопии НИИ экспериментальной онкологии и биомедицинских технологий Приволжского исследовательского медицинского университета (ПИМУ), руководитель проекта РНФ «Макроимиджинг опухолей с использованием спектрального анализа и временным разрешением» , один из ведущих мировых экспертов в области использования времяразрешенной флуоресцентной микроскопии и макроскопии для биологических и медицинских исследований.
― Что представляет собой время жизни флуоресценции и с какой целью его измеряют?
― То, с чем мы работаем, то есть свет, свет обладает двумя легко различимыми характеристиками: интенсивностью, или яркостью, и спектром, определяющим его цвет. Однако, существуют и невидимые параметры, например, поляризация света (ориентация вектора электрического поля световой волны) и время жизни флуоресценции, которое, тем не менее, возможно измерить. Время жизни флуоресценции представляет собой средний период, в течение которого молекула (флуорофор) находится в возбужденном состоянии, прежде чем перейти в основное состояние с испусканием флуоресцентного фотона. Для перехода молекулы в возбужденное состояние необходимо воздействие света.
В случае фундаментальных исследований продолжительность флуоресценции в значительной степени определяется свойствами среды, в которой находится излучающая молекула, такими как вязкость, температура, щелочность и другие. Каждый флуорофор ( флуоресцентное химическое соединение, способное повторно излучать свет при возбуждении светом. ― Примеч. ред.) каждая молекула обладает собственным временем жизни, которое зависит от физико-химических характеристик окружающей ее среды. Следовательно, анализ времени жизни позволяет изучать свойства среды, в которой находится флуорофор. Измерение времени флуоресценции играет важную роль в диагностике и лечении онкологических заболеваний, что делает его актуальным для медицинских применений. В настоящее время мы активно разрабатываем флуоресцентный макроимиджинг, направленный на решение подобных медицинских задач.
― Мы обсуждаем флуоресцентную микроскопию с временным разрешением. В чем ее отличие от обычной флуоресцентной микроскопии, не имеющей временного разрешения?
— Действительно, люди давно применяют стандартную микроскопию. Флуоресцентные микроскопы, которые позволяют наблюдать за флуоресценцией, широко распространены в физических и медицинских лабораториях. С их помощью обычно измеряют только интенсивность свечения. Как я уже упоминал, мы же, в отличие от этого, определяем не только яркость, но и время жизни флуоресценции.
В процессе проведения измерений данные подвергаются обработке. Кривые затухания флуоресценции анализируются с помощью аппроксимации, что позволяет нам определить время ее жизни.
― Имеет ли для вас значение его продолжительность? Какие целевые показатели вы преследуете?
— Ввиду того, что мы изучаем эндогенную флуоресценцию, обусловленную молекулами, уже присутствующими в ткани, и не используем внешние красители, мы не имеем возможности активно изменять время жизни флуоресценции, и это не является необходимостью. Для наших экспериментов важнее другие ключевые аспекты. Прежде всего, это высокочувствительные детекторы. Наша методика основана на режиме счета отдельных фотонов, поскольку автофлуоресценция – процесс слабовыраженный, и поэтому требуются детекторы фотонов высокой чувствительности. Следующий, весьма важный для регистрации подобных процессов фактор – наличие электроники, позволяющей осуществлять подсчет фотонов. Существует множество способов измерения времени жизни, однако мы применяем так называемый время-коррелированный счет фотонов: мы определяем не только количество фотонов в определенный момент времени, но и задержку относительно импульса возбуждающего света (лазера), получая в результате гистограмму распределения фотонов по времени. Для этого необходима электроника, отличающаяся высокой точностью.
― Впервые в России был разработан метод экспресс-диагностики биологических тканей, основанный на анализе времени флуоресценции. Расскажите, как вам это удалось?
— Я прожил в Германии на протяжении 12 лет и работал в организации, специализирующейся на разработке электроники для подсчета фотонов. Моя роль заключалась в создании инновационных оптических систем и методов, основанных на подсчете фотонов. Эти оптические системы применимы для установки на микроскопы, спектрофотометры или другое оборудование, предназначенное для измерения времени флуоресценции. По возвращении в Россию я продолжил эту деятельность, но уже в стенах Приволжского исследовательского медицинского университета.
― В чем заключается разница между флуоресцентной микроскопией с временным разрешением и биологической просветкой тканей?
— Научные методы, которые мы сейчас обсуждаем, объединены общим термином ― биофотоника. Просветление представляет собой альтернативное направление в биофотонике, которое дает возможность наблюдать процессы, протекающие не только на поверхности ткани, но и в ее внутреннем слое. В нашей работе мы в основном проводим стандартные измерения, касающиеся только поверхности. В некоторых ситуациях выполняются эндоскопические исследования, при которых свет подается через оптическое волокно для активации флуоресцентных меток. Таким образом, время жизни флуоресценции потенциально может быть зафиксировано и с помощью эндоскопа.
― Какова может быть максимальная продолжительность флуоресценции?
— Флуоресценция — это переход молекул из возбужденного состояния в основное, и он протекает достаточно быстро. Обычно это занимает от десятков пикосекунд ( пикосекунда равна одной триллионной доле секунды. — Примеч. ред ) до десятка наносекунд (наносекунда — это одна миллиардная часть секунды (прим. ред ). Это очень короткое время жизни.
Наряду с флуоресценцией, нами исследуется и фосфоресценция – особый вид люминесценции, характеризующийся тем, что вещество, поглотившее свет, испускает его не моментально, а с задержкой. Это более продолжительный процесс. Продолжительность фосфоресценции изменяется в пределах от 1 микросекунды до 1 секунды. Свойство фосфоресцировать делает молекулу полезной, например, для создания сенсоров, чувствительных к кислороду.
― Это помогает распознавать патологические клетки?
— Да, это один из метаболических аспектов, связанных с изучением кислорода. Существенно, что измерение времени флуоресценции позволяет определить, является ли клетка жизнеспособной. Обычно такие чувствительные измерения проводятся в оперативном режиме, поскольку клетки, как и ткани, не отличаются долговечностью, и для работы с ними требуется соблюдение определенных условий.
― Возможна ли адаптация подобных экспресс-методов диагностики для использования в клинической практике в будущем?
— Именно этого мы и хотели достичь. В настоящее время совместно с коллегами из ПИМУ я провожу исследования в области макроимиджинга: это не микроскопия, а макроскопия, позволяющая изучать объект в целом. Разрабатываемые нами методы, основанные на коррелированном учете фотонов, позволят с помощью измерения времени жизни флуоресценции проводить диагностику лимфатических узлов и выявлять наличие в них метастазов. Это актуальная медицинская задача. В случае, например, рака молочной железы, после хирургического удаления лимфатического узла проводят гистологическое исследование для определения наличия метастазов. Обычно это занимает одну-две недели. Пациента в это время переводят из операционной в палату ожидания результатов. В зависимости от них, ему либо удаляют, либо сохраняют оставшиеся лимфоузлы. Разработанный нами метод быстрой флуоресцентной макроимиджинговой диагностики с временны́м разрешением (макро- FLIM) это позволяет выполнить гистологическое исследование всего за пять-десять минут.
― Благодаря этому пациенту не потребуется неделя или даже две, чтобы узнать результаты обследования и мучиться от неопределенности относительно наличия метастазов.
— Безусловно, это значимый психологический фактор. Помимо этого, присутствует и экономический аспект: отсутствие длительного пребывания в стационаре позволит снизить финансовые затраты.
― Возможно ли будет в дальнейшем использовать эту методику для других органов?
— Я полагаю, это вполне достижимо. В ПИМУ ведется масштабное научное исследование, охватывающее не только лимфоузлы, но и глиомы – опухоли головного мозга. Перед исследователями стоит задача отличить опухоль от здоровой ткани для точного определения границ хирургического вмешательства, чтобы нейрохирург мог удалить только пораженные участки, избегая избыточного воздействия. Мы также взаимодействуем с коллегами из МГУ им. М.В. Ломоносова в сфере применения искусственного интеллекта для анализа обширных объемов информации. В реализации масштабирования нашей разработки принципиальных ограничений не наблюдается, однако для каждого типа тканей потребуется индивидуальная настройка диагностических параметров, позволяющих различать нормальное и патологическое состояние.
— В своих лекциях вы подробно рассказываете про метаболизм, патологические клетки и т.д. При этом вы кандидат физико-математических наук. Как вам это удается? Занимаетесь ли вы биологией и медициной в свободное время?
— Я вынужден разбираться в этих вопросах. К счастью, в нашем институте работает много биологов и биофизиков. Помогает и консультирует меня моя жена, Марина Вадимовна Ширманова, доктор биологических наук.
— Какие тенденции в вашей сфере деятельности вы могли бы выделить?
— В последние годы в биофотонике значительные усилия направлены на совершенствование методов микроскопии, обеспечивающих сверхвысокое разрешение (50 нм и ниже). В отличие от этого, макроимиджинг, по моему мнению, характеризуется ограниченной разрешающей способностью.
«Термин «макро» позволяет изучать объекты, габариты которых составляют 2 × 2 см, такие как лимфоузлы, размеры которых колеблются от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров. В биофотонике одним из ключевых направлений является создание методов диагностики, не требующих инвазивного вмешательства. В настоящее время достижения в этой сфере находят применение в клинической практике.
— В каких еще областях, кроме медицины, находит применение флуоресценция с временным разрешением? Существуют ли какие-либо малоизвестные способы использования этой технологии?
— Безусловно, такая технология существует и может быть использована, например, при исследовании картин и проверке их подлинности. Анализ слоев краски с помощью методов определения времени флуоресценции позволяет приблизительно определить год создания картины и ее возраст. Установить точную дату, конечно, не представляется возможным, но, на мой взгляд, определение столетия, в котором она была создана, вполне достижимо. Такие исследования справедливо называют объединением науки и искусства.
Беседа была осуществлена при содействии Министерства науки и высшего образования Российской Федерации