Оптогенетика представляет собой инновационный и действенный метод, используемый биофизиками для контроля над клетками и внутриклеточными процессами посредством светового воздействия. В основе метода лежат различные микробные родопсины – белки, содержащие ретиналь в качестве кофактора и осуществляющие транспорт ионов через мембраны под действием света. В рамках недавнего исследования специалисты из МФТИ применили белок Arch3, выделенный из архей, для повышения кислотности среды внутри раковых клеток, выращиваемых в лабораторных условиях. Это привело к ускоренному образованию активных форм кислорода и спровоцировало запрограммированную клеточную гибель (апоптоз). Результаты опубликованы в журнале «Биохимия».
Оптогенетика – относительно новое направление в биологии, однако уже сейчас она представляет собой эффективный и точный инструмент для воздействия на клетки. В первую очередь, это касается возбудимых клеток, то есть тех, которые способны реагировать активными процессами на внешние сигналы. К ним относятся нейроны, мышечные клетки и клетки желез.
Достижения в области нейронов также заслуживают особого внимания: возможно возбуждение или подавление нейронов, картирование нейронных сетей, а также, вероятно, применение оптогенетики для терапии глухоты и слепоты. Этот подход также эффективен для изучения сложных физиологических процессов, происходящих в невозбудимых клетках. В частности, можно исследовать их отдельные структуры, такие как органеллы и компартменты, и отслеживать изменения в различных параметрах окружающей среды.
Показатель кислотности (pH) играет ключевую роль в нормальной работе клетки и ее компонентов. Отклонения от нормы, как в сторону закисления, так и в сторону защелачивания, могут быть связаны с различными патологическими процессами при болезнях.
Внутри митохондрий, в частности в матриксе, имеет значение показатель кислотности. Эти клеточные «энергетические станции» играют ключевую роль в жизненном цикле клетки и ее гибели, поскольку в процессе своей деятельности они вырабатывают активные формы кислорода (АФК). В небольших концентрациях АФК выполняют важные регуляторные функции, однако их резкое увеличение становится губительным для клетки. В нормальных условиях матрикс митохондрий характеризуется слабощелочной средой (pH около 8), и любые отклонения от этого значения могут спровоцировать запуск апоптоза — запрограммированной клеточной гибели.
Существенное влияние на производство АТФ митохондриями оказывает их внутренняя кислотность. Оба этих параметра в настоящее время активно исследуются, так как они значимы для понимания развития различных патологий, включая болезни сердца, диабет, нейродегенеративные заболевания и рак.
Биофизики из Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ, являющиеся авторами новой статьи, обратили внимание на эти вопросы. В своей работе они подчеркивают, что в клетках млекопитающих наблюдается тесная взаимосвязь между защелачиванием матрикса, генерацией активных форм кислорода и передачей сигналов посредством ионов кальция. В определенных ситуациях, как отмечают ученые, эти факторы, как в совокупности, так и по отдельности, могут приводить к образованию пор в мембранах митохондрий и, как следствие, к гибели клетки. В данном контексте, формирование активных форм кислорода выступает в качестве важного этапа на пути клетки к апоптозу.
Ученым в их работе содействие оказали флуоресцентные сенсоры — молекулы, демонстрирующие избирательное накопление внутри клеток и в их митохондриях. Смена спектров флуоресценции указывала на присутствие перекиси водорода H 2O2. Данное соединение относится к АФК, и его концентрация позволяет оценить общий уровень окислительного стресса, который представляет собой дисбаланс между активными формами кислорода и антиоксидантными системами, нейтрализующими их.
Впервые в данной работе исследовано формирование арфк в процессе оптогенетически индуцированного изменения кислотности цитоплазмы – внутренней среды клетки. В качестве инструментария применен протонный насос Arch3 – белок, выделенный из археи Halorubrum sodomense, при воздействии света определенной длины волны, данный механизм извлекает катионы водорода из клетки, перенося их во внешнюю среду. Это приводит к снижению их концентрации внутри клетки и повышению показателя кислотности. Проще говоря, происходит защелачивание цитоплазмы — основной среды клетки.
Arch3 был экспрессирован на цитоплазматической мембране клеток HeLa, представляющих собой культивируемую линию «бессмертных» клеток карциномы человека. В цитоплазме и внутри митохондрий этих клеток находились молекулы-сенсоры HyPer7, способные реагировать на перекись водорода. HyPer7 – это флуоресцентный краситель, который при возбуждении на длине волны 405 нм (фиолетовый свет) проявляет яркую флуоресценцию. Однако, после взаимодействия с перекисью водорода, происходит изменение свойств HyPer7, и его возбуждение становится более эффективным при длине волны 488 нм (голубой свет.
При анализе данных авторы учитывали соотношение интенсивностей флуоресценции при возбуждении на разных длинах волн, чтобы исключить влияние артефактов, возникающих при спектральных измерениях. К таким артефактам относятся, например, сдвиг pH, изменение формы клеток, их перемещение, смещение оптического фокуса и другие факторы. В соответствии с ожиданиями, оптогенетически вызванное защелачивание привело к значительному увеличению концентрации перекиси водорода — одного из ключевых активных форм кислорода — как в цитоплазме, так и внутри митохондрий.
Изменение pH в митохондриальном матриксе происходило практически одновременно с активацией протонного насоса Arch3, тогда как генерация АФК начиналась с задержкой. Это свидетельствует о том, что в процессе «щелочного апоптоза» клеток ключевую роль играет образование перекиси водорода и аналогичных соединений, однако механизмы этой сложной взаимосвязи требуют дальнейшего изучения.
«Нами было показано, что продолжительное оптогенетическое защелачивание цитозоля вызывает образование активных форм кислорода внутри клетки, представляющих собой “кислородному взрыву”. Это может являться одним из факторов, инициирующих клеточную гибель вследствие повышения кислотности цитозоля. Исследование связи между внутриклеточным рН и уровнем АФК имеет значение как для раскрытия базовых принципов клеточной физиологии, так и для понимания патологических процессов, таких как злокачественная трансформация, онкологические заболевания или нейродегенерация» , — отметила Анастасия Власова, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной клеточной биологии и оптогенетики Центра исследования молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний Московского физико-технического института.
В научной статье Kravtsunova, D.E., Bukhalovich, S.M., Gromova, A.A. и др. описывается образование активных форм кислорода в митохондриях и цитозоле в результате оптиогенетической алкализации цитозоля в клетках человека. Статья опубликована в журнале «Биохимия. Московский сборник. Серия А» (том 19, выпуск 180–187, 2025) и доступна по ссылке: https://doi.org/10.1134/S1990747825700126