Биолог Дмитрий Дмитриевич Жданов поделился с корреспондентом «Научной России» информацией об альтернативном сплайсинге РНК – важном процессе, происходящем при использовании генетической информации. Этот процесс обеспечивает разнообразие белков в организмах всех живых существ. Какова связь альтернативного сплайсинга с развитием болезней и старением, и возможно ли его контролировать? Когда и как он возник, и каково его основное эволюционное значение? Подробности – в нашем интервью.
Справка: Дмитрий Дмитриевич Жданов ― доктор биологических наук, заведующий лабораторией медицинской биотехнологии НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича (ИБМХ), руководитель проекта РНФ «Изменение активности подавляющих регуляторных Т-клеток человека посредством стимуляции альтернативного сплайсинга пре-мРНК FoxP3» (2023–2024) — профессор кафедры биохимии имени академика Т.Т. Березова Российского университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы, обладатель премии Правительства Москвы молодым ученым за 2022 год. Тема докторской диссертации Д.Д. Жданова: «Роль эндонуклеазы EndoG в регулировании альтернативного сплайсинга пре-мРНК апоптотических белков» признана ВАК одной из лучших в 2020 г.
― Что представляет собой сплайсинг РНК?
― Изначально термин «сплайсинг» применялся в мореплавании и описывал метод соединения канатов, исключающий использование узлов. Splice переводится с английского языка как «соединять». Если говорить о биологии, то процесс сплайсинга связан с созреванием промежуточного звена РНК. Известно, что информация о последовательности аминокислот в белке закодирована в структуре ДНК. Экспрессия генов, то есть считывание РНК с матрицы ДНК, называется транскрипцией. После ее реализации наступает этап созревания РНК, а после этого с матрицы РНК (в ходе трансляции) происходит непосредственно синтез молекулы белка.
В процессе транскрипции ДНК в РНК в молекулу РНК включаются как экзоны, так и интроны. Полученная структура называется пре-мРНК или предварительной матричной РНК. После этого некодирующие участки, интроны, удаляются из пре-мРНК, а кодирующие участки соединяются, что называется сплайсингом.
― Да, так и есть.
― А что происходит с вырезанными кусками?
― Эти структуры подвергаются разрушению. Клеточная система контроля РНК идентифицирует их как дефектные нуклеиновые кислоты и расщепляет до отдельных нуклеотидов.
― Является ли интронная область ДНК бесполезной?
― Нет. Они содержат регуляторные последовательности, которые требуются для осуществления экспрессии генов и проведения альтернативного сплайсинга.
― В чем разница между альтернативным сплайсингом и сплайсингом, который мы ранее обсуждали?
― Альтернативный сплайсинг представляет собой механизм, посредством которого происходит выборочное удаление, перестановка или включение экзонов в готовую мРНК, то есть этот процесс осуществляется после того, как все интроны были удалены. Различают различные типы альтернативного сплайсинга, причем наиболее часто встречающийся – удаление или включение экзонов – характерен для всех млекопитающих, включая человека.
― Происходит ли альтернативный сплайсинг и у бактерий?
― Да, он присутствует у всех живых организмов, обитающих в природе.
― Действительно ли существует версия, что интроны когда-то были паразитами, которые были удалены из организма, но затем каким-то образом смогли закрепиться в нем?
― С точки зрения эволюции, события, связанные с появлением альтернативного сплайсинга, представляют большой интерес. Изначально интроны, вероятно, являлись нефункциональными фрагментами, которые могли быть занесены в геном первых организмов вирусами. Также возможно их возникновение вследствие случайных генетических мутаций и перестроек хромосом, при которых участок ДНК переносится с одной хромосомы на другую. Альтернативный сплайсинг можно интерпретировать как механизм, посредством которого клетки приспосабливаются к меняющимся условиям окружающей среды.
― Какую ключевую роль играет альтернативный сплайсинг с точки зрения эволюции?
― Прежде всего, это связано с тем, что он обуславливает разнообразие белков. Альтернативный сплайсинг позволяет одному гену кодировать сразу несколько белков, обладающих гомологичной структурой и определенной степенью сходства. Однако, эти белки все равно будут иметь некоторые, пусть и незначительные, различия, что может приводить к изменению их функций. Способность одного гена кодировать сразу несколько белков определяет также и определенную компактизацию генома: альтернативный сплайсинг позволяет более эффективно использовать информацию. Также он обеспечивает определенную адаптивность в процессе эволюции.
Возникает вопрос: зачем клетке требуется такое большое количество изоформ, то есть структурно схожих белков? Однако, если произойдет сбой, эти изоформы могут либо защитить клетку от необратимых повреждений, либо, наоборот, спровоцировать ее гибель, что может быть необходимо для поддержания здоровья организма.
― Как и когда был открыт альтернативный сплайсинг?
― В 1970-х годах американские биологи Филлип Шарп и Ричард Робертс проводили исследования аденовирусов в Массачусетском технологическом институте. В ходе работы они выявили, что на одном гене вируса возможно формирование пяти различных транскриптов, представляющих собой копии мРНК (которая впоследствии служит основой для синтеза белков), посредством двух независимых механизмов. За это открытие в 1993 году ученые получили Нобелевскую премию, которая была присуждена за «открытие разделенных генов».
― По сути, за обнаружение прерывистой, дискретной структуры гена?
― Да. Позднее было установлено, что кодирующие и некодирующие области, экзоны и интроны, присутствуют не только у вирусов, но и у бактерий, грибов и всех остальных живых существ.
― Как давно известен этот механизм альтернативного сплайсинга?
― Точно определить это непросто. По моему мнению, его возникновение пришлось на время, когда сформировался механизм реализации генетической информации, известный как «ДНК ― РНК ― белок», что произошло примерно 4 миллиарда лет назад.
― То есть не в мире РНК, а в более поздний период, когда уже возникла ДНК?
― Существуют различные взгляды на этот вопрос. На самом деле, подобное могло произойти и раньше, еще в эпоху РНК. Раньше РНК могла выполнять функции независимо, и, соответственно, первые примитивные организмы могли уже тогда обладать механизмом альтернативного сплайсинга. К примеру, такую позицию поддерживает Филлип Шарп.
― В одной из своих лекций он также отмечал, что примерно четверть всех мутаций, способных привести к болезням, устраняются в ходе альтернативного сплайсинга.
― Альтернативный сплайсинг способен не только обеспечивать защиту от некоторых болезней, но и, в отдельных случаях, вызывать их развитие.
Карликовость – одно из наиболее известных заболеваний, характеризующихся замедлением роста. Соматотропин, гормон, играющий важную роль в развитии организма, обычно имеет молекулярную массу 20 кДа. Однако при карликовости, вследствие нетипичного альтернативного сплайсинга, из мРНК, кодирующей этот гормон, удаляется третий экзон, и в организме вырабатывается дефектный белок – соматотропин, имеющий меньший размер (17 кДа). Это препятствует нормальному выполнению его функции.
― Как правило, мутации в организме преимущественно возникают в экзонах, которые представляют собой кодирующие участки генома, а не в интронах?
― Различно. Это определяется местоположением мутации и тем, какой функциональный участок она затрагивает. Существенные мутации могут возникать как в экзонах, так и в интронах. Поэтому мы подчеркиваем, что интроны не всегда являются «мусорными» участками генома. Как я уже отмечал, они играют важную роль в регуляции генов и обеспечении реализации генетической информации.
― Возможно ли терапевтическое воздействие на дефекты альтернативного сплайсинга, которые вызывают различные заболевания?
― Да, в настоящее время в мире уже существуют два успешных примера: в США разработаны медикаменты, воздействующие на процесс альтернативного сплайсинга. Первым заболеванием, для лечения которого одобрено такое лекарство, стала спинальная мышечная атрофия, а вторым – мышечная дистрофия Дюшенна, также характеризующаяся поражением скелетных мышц. Таким образом, исследования в этой области продолжаются.
― Как альтернативный сплайсинг связан со старением?
― Старение представляет собой сложный процесс, затрагивающий все функциональные системы организма. Учитывая, что белками обусловлена основная работа внутренних органов, старение также приводит к изменениям в их функционировании, включая нарушения альтернативного сплайсинга. Это подтверждается недавним исследованием наших китайских коллег, которые проанализировали РНК-последовательности более чем у 1 тыс. пациентов и обнаружили изменения в сплайс-вариантах свыше 6 тыс. белков.
― Значит, с возрастом происходит нарушение механизма альтернативного сплайсинга?
― Я бы не сказал, что сам механизм альтернативного сплайсинга нарушается; меняется лишь набор мРНК, образующихся в результате этого процесса. Направление этих изменений необходимо оценивать в каждом конкретном случае.
― Я провожу исследования, посвященные изучению влияния альтернативного сплайсинга на развитие аутоиммунных заболеваний, в лаборатории медицинской биотехнологии НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича. Какие аспекты этой работы показались вам наиболее захватывающими и наиболее трудными?
― Хочу напомнить, что при данных заболеваниях иммунная система начинает воздействовать на собственные здоровые клетки и ткани организма. Наша работа связана с тремя аутоиммунными заболеваниями: рассеянным склерозом, боковым амиотрофическим склерозом и синдромом Шегрена. Мы проводим эксперименты с регуляторными Т-клетками, дисфункция которых наблюдается у пациентов с указанными диагнозами.
Этот белок называется FOXP3. По аналогии с упомянутым ранее лекарственным средством, применяемым для лечения спинальной мышечной атрофии, были отобраны олигонуклеотиды ( короткие фрагменты ДНК или РНК, состоящие из нескольких нуклеотидов. ― Примеч. ред.), способные таргетно взаимодействовать с пре-мРНК FOXP3 и переключать его альтернативный сплайсинг в сторону синтеза функционально активного белка.
Наибольшие трудности у нас возникли при определении оптимальной последовательности терапевтических олигонуклеотидов, влияющих на альтернативный сплайсинг. Первоначально, с использованием специализированных программ на основе искусственного интеллекта, необходимо было выявить регуляторный участок альтернативного сплайсинга, который должен быть подвергнут воздействию. Затем, уже с применением человеческого интеллекта, мы приступили к анализу соответствия этого участка нашим требованиям. После этого начался процесс подбора олигонуклеотидов, способных модулировать альтернативный сплайсинг. Суть сложности подобной работы заключается в том, что если олигонуклеотид окажется недостаточно длинным (мы рассматривали варианты от 20 азотистых оснований), то он может быть специфичен к множеству других участков в геноме и вызвать нежелательные побочные эффекты. В то же время, избыточная длина может значительно затруднить его доставку в клетку. Процесс доставки подобных геннотерапевтических препаратов в клетку представляет собой одну из ключевых задач современной науки. Выполняя такую работу, мы должны действовать с большой осторожностью, соблюдая баланс между специфичностью и эффективностью трансфекции ( введения нуклеиновой кислоты в эукариотические клетки невирусным методом. ― Примеч. ред .). Это и стало для нас самым главным вызовом.
Беседа была осуществлена при содействии Министерства науки и высшего образования Российской Федерации